m6A RNA甲基化片段富集试剂盒(qPCR版)

起始材料：

RNA输入量：每次反应的总RNA数量范围是：1ug - 20ug 。最佳数量是：每次反应是10ug ，m6A含量一般小于总RNA的0.1%。起始RNA可能在水中或缓冲液中，如TE。RNA应该是高质量的，没有DNA污染。可以用DNAse I去除DNA，RNA应在无RNase的水中洗脱。

RNA储存：RNA应该储存在 - 20°C 或 80°C直至使用为止。

1. 免疫捕获和裂解：

a. 根据如下表格将试剂加入0.2ml 的PCR管中，配制免疫捕捉液，并混匀：

注：1) 每个组成部分的最后数额应为 (a) 感兴趣的抗体：2ug/管和(b) 非免疫IgG：2µg/管。2) 摇动 Affinity Beads，在使用前使其完全悬浮。

b.室温下，在涡旋仪涡旋管子或在滚动的摇床上，涡旋90分钟。

c. 经过90分钟的孵育后，添加 10ul 的 NDE（Nuclear Digestion Enhancer），2ul 的CEM（Cleavage Enzyme Mix）到每个管子中并室温孵育4分钟。

d. 把管子放在磁力架上，直至溶液澄清（约2分钟）。 小心移除并丢弃上清液（注意：小心不要干扰或丢弃含有RNA的珠子）。：

输入可以根据如下步骤剪切

在20µl ICB（Immuno Capture Buffer）中加入1-2µl (200-400ng) 的RNA，然后加入1.5µl NDE（Nuclear Digestion Enhancer）、1µl CEM（Cleavage Enzyme Mix）在室温下孵育2分钟。然后进入2d步骤进行RNA释放/回收。

e.将PCR管保存在磁力架中，用150µl WB（Wash Buffer）清洗每个反应管三次，并用150µl PDB（Protein Digestion Buffer）清洗一次。 清洗可按如下进行：溶液去除后，在反应管中加入WB（Wash Buffer）。 轻轻地上下移动几次，重新悬浮珠子。确保珠子完全重新悬浮并且珠子不会粘在吸头尖处。将管子放回磁力架中1-2分钟，使珠子颗粒化，然后从每次反应管中取出并丢弃溶液。

2. 富集RNA的释放/回收：

a. 混合Proteinase K与PDB（Protein Digestion Buffer）以1:10（例如：1ul 的ProteinaseK + 9ul PDB）来制备 Protein Digestion Solution。

b. 最后一次清洗后，从磁力架上取出管子。在每个样品和阴性对照中加入20µl ProteinDigestion Solution。在热循环仪中(没有加热盖子)55°C下混合和孵育15分钟。

c. 把管子放在磁力架上，直至溶液澄清（约2分钟）。小心地将溶液从每个样品转移到一个未使用的PCR管中。

d. 在每个样品和阴性对照管中填加20 ul 的RPS (RNA Purification Solution)，然后加入160 ul的 100% 乙醇。将25 ul的 RPS (RNA Purification Solution) 放入输入管中，然后加入200 ul的100% 乙醇。

e. 通过涡旋重新悬浮RNA Binding Beads。 在每个管子中加入 2µl 再悬浮的珠子。通过移液器上下吹打至少10次，彻底混匀。

f. 室温下孵育5分钟，使RNA与珠子结合。

g. 将PC R管放入磁力架，直到溶液清澈（约2分钟）。 小心移除并丢弃上清液。(注意：小心不要搅乱或丢弃那些有可能含有RNA的珠子)。

h. 将PC R管放入磁力架中，在管中填加 150µl 新鲜制备的 90%乙醇，然后小心地取出并丢弃乙醇。

i. 重复步骤2h一次，共洗两次。

j. 将珠子重新悬浮在 13µl 的 Elution Buffer 中，室温孵育5分钟，从珠子中释放RNA。

k. 通过将管子放置在磁力架中捕捉珠子，直到溶液完全清晰（约1分钟）。

l. 从每个样品中转移 13µl 到新的 0.2ml PC R管中，立即使用或储存在-20°C。

注：（1）富集 RNA 的浓度可以用荧光法简单地定量，通过阳性对照和阴性对照的比较或在样品和IgG对照之间。 例如，取1ul 洗脱RNA采用RNA或ssDNA定量方法对其进行定量；（2）使用富集RNA基于测序可进行文库构建，或您可使用您自己成功的RNA文库构建方法或使用从Illumina或NEB提供的RNA文库制备试剂盒。