咨询热线
15210716102
|
|
|
|
英文名称：EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit (Colorimetric) 中文名称：EpiQuik m6A RNA 甲基化定量检测试剂盒(比色法) 甲基化试剂盒 Epigentek-北京博迈斯科技发展有限公司 操作手册
为了得到最好的实验结果，在实验开始前，请通读这个操作手册。 1. 起始材料： RNA输入量：RNA每次反应量范围在100 ng-300 ng。最佳输入量是每次200 ng.起始的RNA应该是在水中或是溶液中比如：TE。你可以使用自己的办法来提取RNA。当然，次手册后附有RNA提取的相关产品。 RNA储存：提取好的RNA可以储存在-20°C（短期）或是在-80°C（长期）直到使用为止。
2. 溶液和试剂制备： a.制备1X Wash Buffer： 48次试剂盒：添加13 ml 的 WB（10X Wash Buffer） 到117 ml 的蒸馏水（最终pH7.2-7.5）中。 96次试剂盒：添加26 ml 的 WB（10X Wash Buffer） 到234 ml 的蒸馏水（最终pH7.2-7.5）中。 这个稀释的WB 1X Wash Buffer现在可以储存在4°C可达6个月。 b.制备稀释的 CA（捕获抗体）溶液： 使用稀释的WB 以1:1000比例稀释CA（如：添加1 ul的CA到1000 ul的稀释的WB中）。每个孔中要求添加约50 ul的稀释的CA。 c. 制备稀释的 DA（检测抗体）溶液： 使用稀释的WB 以1:2000比例稀释DA（如：添加1 ul的DA到2000 ul的稀释的WB中）。每个孔中要求添加约50 ul的稀释的DA。 d. 制备稀释的 ES（增强液）溶液： 使用稀释的WB 以1:5000比例稀释ES（如：添加1 ul的ES到5000 ul的稀释的WB中）。每个孔中要求添加约50 ul的稀释的ES。 e.制备稀释的阳性对照： 单点对照：使用1X TE到0.5ng/ul （1 ul PC +3 ul TE）稀释PC（阳性对照）。
建议的标准曲线：第一，使用1X TE到0.5ng/ul （如：3 ul PC + 9 ul 1X TE）稀释PC（阳 性对照）。使用稀释的WB 以1:2000比例稀释DA（如：添加1 ul的DA到2000 ul的稀释的 WB中）。然后，根据如下稀释表使用0.5ng/ul PC和1X TE制备6种不同浓度，0.01，0.02， 0.05，0.1，0.2和0.5ng/ul。
注：保证每种稀释液(除稀释液 WB)在冰上操作，直至使用。任何稀释的溶液，除稀释的WB外，所有不在同一天稀释的溶液都应当丢弃。
3. RNA结合： a. 预先计算实验所需的8联管数量。小心的从板架上取下暂不需要的联管并将它放回袋子中（紧紧将袋口封上并储存在4°C）。 b. 添加 80 ul 的 BS（结合液）到每孔中。 c. 添加 2 ul 的 NC，2 ul 的 稀释的PC（看下面的注释），和200 ng的你的样本RNA （1-8 ul）到表1和表2描述的指定的孔中。轻柔的从一边到另一边混合溶液或轻轻摇晃板子几次。确保溶液均匀地覆盖住每个孔底。 注：1）对于单点阳性对照，以步骤2e准备好的浓度0.5 ng/ul 添加 2 ul 的 PC ；对于标准曲线，以步骤2e表中准备好的浓度0.01-0.5 ng/ul 添加 2 ul 的 PC。每孔最终的量应该是0.02，0.04，0.1，0.2， 0.4和1 ng。 2）为了最佳的结合，RNA的样本量体积不应该超过 8 ul 。 3） 确保 NC，稀释的PC，和样本RNA完全添加到孔中，将吸头放在 BS 孔溶液中并啐打1-2次。 d. 使用封板膜或封口条封好联管并在37°C孵育90分钟。 e. 从每孔上移走 BS（结合液）。通过稀释的 WB 使用 150 ul 稀释的 WB 清洗每孔并使用吸头移走溶液。重复清洗2次。总共清洗3次。
4. 捕获m6A RNA： a. 添加 50 ul 的稀释液 CA 到每孔中，然后覆盖并在室温下孵育 60 分钟。 b. 使用移液器从每孔中移走 稀释的 CA 。 c. 每次使用 150 ul 的稀释的 WB 清洗每孔3次。 d. 添加 50 ul 的稀释的 DA 到每孔，然后覆盖并在室温下孵育 30 分钟。 e. 使用移液器从每孔中移走 稀释的 DA 。 f. 每次使用 150 ul 的稀释的 WB 清洗每孔4次。 g. 添加 50 ul 的稀释的 ES 到每孔，然后覆盖并在室温下孵育 30 分钟。 h. 使用移液器从每孔中移走 稀释的 ES 。 i. 每次使用 150 ul 的稀释的 WB 清洗每孔5次。
5. 信号检测： a. 添加 100 ul 的 DS 到每孔中并室温避光孵育 1-10 分钟。开始监测样本孔和阳性对照孔的颜色变化。在充足的 m6A 下，DS 溶液将变成蓝色。 b.当阳性对照孔的颜色变成中度蓝色时，需添加 100 ul 的 SS 到每孔中阻止酶反应。在添加 SS 后，颜色将变成黄色；并在2-15分钟内使用酶标仪读取在 450 nm 处的吸光值。 注：如果联管板架不适合酶标仪，转移溶液到一个新的96微孔板中。 6. 计算m6A 相对定量：确定二份不同样本RNA中相对定量的 m6A RNA 甲基化状态，采用如下的公式简单计算总RNA中 m6A 的百分比。
S 是以 ng 计算RNA样本输入量。 P 是以 ng 计算阳性对照（PC）输入量。
计算举例： NC OD450 均值是0.1 PC OD450 均值是0.4 样本 OD450 均值是0.16 S 是 200 ng P 是 1 ng
绝对定量：使用精确的公式绝对定量计算 m6A 的量。首先，绘制标准曲线和OD值的斜率与在每个浓度点的PC的量。其次，使用线性回归绘制标准曲线（Microsoft Excel的线性回归函数适用于这样的计算）。使用最标准的线性回归(至少包含4个浓度点)绘制斜率。现在，使用如下的公式计算总RNA中 m6A 的量和百分比。
S 是以 ng 计算RNA样本输入量。 计算举例： NC OD450 均值是0.10 样本 OD450 均值是0.16 斜率 是 0.3 OD/ng S 是 200 ng
|